目前，现有的DNA重组技术不外乎以下两类：
依赖于粘性末端的酶切连接。其中最具代表的有基于TypeIIS限制性内切酶建立起来的GoldenGate技术(Engleretal.,;Engleretal.,;Engleretal.,)，以及后续结合GoldenGate和BioBricks技术建立起来的BioWalk技术(Andersonetal.,;Shettyetal.,)；依赖于同源臂的同源重组技术。其中最具代表的是In-Fusion技术(Willeretal.,;Zhuetal.,)和GibsonAssembly技术(Gibsonetal.,;Gibsonetal.,)。但是，现有的两类方法均有其明显的不足之处。首先，GoldenGate技术因克隆片段中可能含有相应的TypeIIS酶切位点而不适合于长片段克隆。迄今为止，只发现两个识别7bp序列的TypeIIS限制性内切酶，即平均每个碱基就可能出现这样一种酶切位点；而对更常用的识别6bp序列的TypeIIS限制性内切酶位点，在长片段中出现的频率更高，因而GoldenGate技术在长片段克隆中使用受限。为解决该问题，LippowSM.等把缺失切割活性的I-SceI及FokI核酸内切酶的非特异性切割活性域相融合，得到了一个全新的长识别序列TypeIIS限制性内切酶(Lippowetal.,)，并且iBrick技术(Liuetal.,)、C-Brick技术(Lietal.,,)、AREs技术(Enghiadetal.,)等的出现，均为解决构建大片段载体缺少合适酶切位点提供了可能。其次，GibsonAssembly技术虽不受组装片段的酶切位点限制，但其克隆小片段和高度重复片段准确性不佳，并且对于10kb片段的再次组装同样面临缺少合适酶切位点线性化载体的问题。基于现有的DNA克隆技术难点，伯远生物研发了BioWalk2.0系统。该系统将LbCas12a与BioRunSeamlessCloningKit(#RDA01)相结合，有效解决了大片段无缝组装的难点，已成功构建多个超过40kb的植物表达载体。BioRunSeamlessCloningKit可将1-5个片段定向重组至载体中，可将50bp-50kb的片段有效克隆至线性化载体，具体方法为：将载体通过酶切或PCR线性化，并在扩增片段正、反向PCR引物5’端引入15-25bp同源序列，使得扩增产物之间以及扩增产物与线性化载体之间各有一段同源序列，各片段和线性化载体在重组酶的作用下，仅需50℃反应15-45min即可进行转化，克隆阳性率可达95%以上。BioRunSeamlessCloningKit可用于基因合成、点突变、灵活增删载体序列及常规克隆等多种实验场景。图1实验原理图，来源：Wikipedia
适用实验场景一、基因合成基因合成具体步骤即将目标双链基因分成若干引物(40-59bp)，使每对相邻互补的引物之间有15-20bp的重叠(Cheongetal.,)，经PCR扩增获得较大基因片段后，将该片段克隆到载体上，并进行测序验证。下面以Pfu-flap为例，进行具体流程详解。图2基因合成原理
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